Előcsarnok a Holy Rood palotában. Azt mondja, hogy a városban zavargások vannak. Valaki, aki ismeretlen a tömeg élén - anyukák, álarcosok, harangtáncosok, fekete kapucnis ember - fenyegette, megjósolta és felszólította az embereket, hogy ne tartsák be a királynőt. Riccio királynő udvarosa megerősíti, hogy időről időre figyel, miközben az emberek lelkesen hallgatják ezeket a prédikációkat. Az oldal azt is elmondja, hogy az emberek belerohantak a királynő kápolnájába, és azt kiabálták: „A papista fészke!”, Hogy Darnley, a királynő férje szarvassága az oltárra ugrott, és prédikációnak kezdett állni, az emberek pedig gúnyos versekkel válaszoltak rá. Mary Stuart királynő kétségbeesetten. Érzi az emberek gyűlöletét; a legtöbb udvarló elhagyta őt; kíváncsi, hogy a kereszténysége mennyiben különbözhet Skócia népének kereszténységétől. Riccio azt javasolja, hogy haladéktalanul készítsen egy rendeletet, amely megbünteti a zavargásokért felelős személyeket. Maria az oldalát diktálja, az oldal tisztázza, hogy kell-e megadni Heinrich Darnley, a királynő férje nevét. Mary habozik; Azt gyanítja, hogy a zavargásokat ő ihlette - elvégre a tömeget a király bütyké vezette. Aztán Riccio emlékezteti őt, hogy ő a királynő; olyan, mint a nap, és joga van büntetni Istentől. Azt követeli, hogy azonnal hívja fel az ügyeletes tisztviselőt a királynő rendeletének bejelentésére. Douglas belép. Maria azt mondja neki, hogy vigye a papírt Morton királyi kancellárhoz, hogy bélyegzzen. Douglas átvizsgálja a rendeletet, és látja, hogy ennek nincs a király neve. Erről kérdezi a királynőt. Riccio felelős érte. Douglas elveszíti temperamentumát. Arra sürgeti a királynőt, hogy ne alkalmazzon véres elnyomó intézkedéseket, és arra utal, hogy ezt francia vagy olasz befolyásként látja. De a királynő hidegen emlékezteti arra, hogy hatalmában áll kiküszöbölni az akaratának engedetlen alanyokat. Riccio és Douglas között veszekedés merül fel. Douglas párbajba szólítja ki Riccio-t és esküszik, hogy holnap meg fogja ölni a velencei embert. A királynő távozik és elviszi Riccio-t. Douglas egyedül marad, párbajt fontolgat. Morton belép. Douglas megmutatja neki a rendeletet. Morton határozatlan: fél a király és a királynő haragjától. Bélyegzés nélkül Morton ajánlja a királyt. Ebben az időben Henry beszélgetést folytatott Nick jesterével, aki megkísérli őt azzal, hogy a királynőnek valódi hatalma van Skóciában, és Henry csak a férje, hogy a királynő közeli személyeket választ, például ezt az olasz hárfista Riccio-t ... Ebben az időben Morton sajnálatos rendeletet hoz. Dühös király úgy dönt, hogy megöli Riccio-t. Lindsay király belép az udvarra, és felhívja a királyt, hogy vadászjon az újonnan megszerzett sólyommal. Morton azt válaszolja, hogy a királynak már van foglalkozása. Lindsay szívesen csatlakozik Riccio ellen a telekhez. Szó szerint tiltja Riccio megölését ma este, mert holnap reggel meg kell ölnie. Ezután Henry, kihasználva a késést, elküldi a jeestert az asztrológusnak, hogy megtudja, mi a csillagok elhelyezkedése szándéka szerint.

A laboratóriumi asztrológus (ő is alkimista) azzal érvel, hogy a tapasztalatok megerősítik a tudomány hiábavalóságát, ebből a célból a csillagok akarata uralja az embert, megsemmisíti a jót és a rosszat. Nick bejön, hírnévvel meghintje, az asztrológus nem alsóbbrendű vele. Nick jelentése szerint a király elküldte, hogy kérdezzen Riccio sorsáról, és megmondja az asztrológusnak, hogy várja meg Riccio halálát. Az asztrológus azt válaszolja, hogy a csillagok megmondják neki, nem pedig az embereknek, és viszont előrejelzi a jeszter halálát. Ezzel távozik. Megjelenik a királynő oldala, amelyet az asztrológus okozott. Page szereti szeretőjét. Az asztrológus azt mondja neki, hogy mondja el a királynőnek, hogy ma az az ember, akit szeret, meghal. - Hogyan, Botwell ma meg fog halni? - kiált fel egy oldal. Az asztrológus zavarban van. Eszébe jutott Riccio, és rohan az oldal, hogy figyelmeztesse őt erről. Egyedül maradva, az asztrológus csodálkozik - a csillagokból is kiderült, hogy Botwell valahogy sötét kapcsolatban áll a királynővel - a Marson, a Szaturnuszon keresztül ... Botwell belép. Monológjából világossá válik, hogy váratlanul az asztrológus házában találta magát. Rájött, hogy hova ment, Botwell megkérdezte az asztrológust, mennyit kell élnie. Az öreg azt válaszolja, hogy három évvel, és hogy Botwell király lesz. A botwell kihúz egy üveg méregmennyiséget, amellyel öngyilkosságot akart tenni, el akarja dobni - és tétovázva. Valójában, a palota érdekeinek légkörében minden fegyver hasznos lesz. Elmegy.

Az oldal azt mondja a királynőnek, hogy Riccio hamarosan eljön. A királynő várja őt - véleménye szerint egyedül ő maradt hűséges neki. - És Botvel? Az oldal megkérdezi. - Ki az a Botvel? - érdekli a királynő. Egy meglepett oldal azt mondja Mary-nek, hogy a csónakázás közben az erős szél a rózsa levágta a királynő fejétől, és egy virág esett a vízbe. Aztán az egyik udvaros - Botvel - berohant a csónakba, és ijedten üldözte az evezőt, hogy elkapjon egy rózsa a vízből. Miután meghallotta a történetet, Mary küld egy oldalt imádkozni. Bevallja Istennek, hogy nincs több ereje, hogy ellenálljon Botwell iránti szeretetének. A királynő tudja, hogy a bíróságon Riccio-ba szerelmesnek tekintik. Riccio belép. Mary egy halálos veszélyről számol be, amely fenyegeti őt, és hidegen búcsút mond neki, a hajóra mutatva, amely Rómába viszi. Kétségbeesetten Riccio megpróbálja könyörgni a királynőt, hogy törölje a távozási döntést. A királynő ravasz.

Heinrich, Morton és Lindsay megtudta Riccio küszöbön álló távozását és sietősen vállalta, hogy megöli vagy vitorlázni engedi. Aztán megjelenik Douglas, és jelentése szerint Riccio már vitorlázott. Douglas kétségbeesetten vágyakozik a véres bosszúra, lovagi tiszteletére fáj. Hirtelen találkoznak egy oldallal, amely Riccio feljegyzését hozza a királynőhöz - ő nem hagyta el, és este vele lesz. Az összeesküvők elveszik a jegyzetet.

Maria elfoglalva hímzik a szobájában. Riccio, aki eljött, elmagyarázza neki, hogy nem tud elmenni, mert reggel párbajban van Douglas-szal. Bevallja, hogy nincs szüksége az életére a szeretet nélkül. Arra kéri Máriát, hogy adjon neki egy rózsa koszorút - virágot ültet az oltárra Rómában. Henry, Douglas és Dindsay jönnek be, és megölik Riccio-t. Királynő elájul. Douglasot szégyen és rémület sújtja - önként visszavonul száműzetésbe. Henry attól tart, hogy a királynő gyűlöli őt. Lindsay elviszi a királyt, és suttogja neki a közelgő vadászatot. Botwell királynőt Queen hívja. Mary érzékeli, látja Botvelt, és bevallja szeretetét vele. A botvel arra kényszeríti őt, hogy beismerje, hogy Henry halálát akarja, és átadja neki méregpalackját, mondván, hogy ez altatót jelent. Mary adja a királynak ezt a "gyógyszert", de a méreg elfogyasztja a büfé. Semmi sem állíthatja meg a gyilkos intrikát - Botwell felrobbantja Henry király házát. A távolban a tömeg egyre növekvő sírása hallható. A királynővel egy botcsont rejtőzik.